رنگ آمیزی گرم یک تکنیک سریع است و برای مشاهده وجود باکتری در نمونه بافت و طبقه بندی باکتری ها بر اساس گرم مثبت و گرم منفی ، بر اساس خواص شیمیایی و فیزیکی دیواره سلولی آنها استفاده می شود. لکه گرم تقریباً همیشه به عنوان اولین قدم در تشخیص عفونت باکتریایی مورد استفاده قرار می گیرد.
این روش رنگ آمیزی به نام دانشمند دانمارکی هانس کریستین گرام (1853 - 1938) نامگذاری شده است ، که این تکنیک را در سال 1882 توسعه داد و آن را در سال 1884 به عنوان تکنیکی برای تشخیص بین دو نوع باکتری با علائم بالینی مشابه منتشر کرد: Streptococcus pneumoniae (همچنین به عنوان استرپتوکوک پنومونیه). پنوموکوک) و باکتری Klebsiella pneumoniae.
گام
روش 1 از 3: آماده سازی اسلاید میکروسکوپ
مرحله 1. برای کار در آزمایشگاه آماده شوید
برای جلوگیری از آلودگی باکتریایی نمونه ای که در حال آزمایش هستید از دستکش و کراوات مو بلند استفاده کنید. فضای کار را در زیر بخاری بخار یا در یک منطقه دیگر با تهویه خوب تمیز کنید. مشعل Bunsen را بررسی کنید و قبل از شروع به کار از درست کارکردن میکروسکوپ اطمینان حاصل کنید.
مرحله 2. اسلاید شیشه ای میکروسکوپ را استریل کنید
اگر شیشه شیشه کثیف است ، آن را با آب صابون بشویید تا روغن و کثیفی از بین برود. اسلایدها را با اتانول ، پاک کننده شیشه یا روش دیگری که آزمایشگاه شما استفاده می کند ، تمیز کنید.
مرحله 3. نمونه را روی سرسره شیشه ای قرار دهید
می توانید از روش رنگ آمیزی گرم برای شناسایی باکتری ها در یک نمونه پزشکی یا فرهنگ باکتری های رشد کرده در یک پتری دیش استفاده کنید. برای بهترین نتایج ، از رنگ آمیزی گرم در ضربات نازک نمونه استفاده کنید. توصیه می شود از نمونه های کمتر از 24 ساعت استفاده کنید ، زیرا ممکن است باکتری های قدیمی به دیواره سلولی آنها آسیب برسانند و به رنگ آمیزی گرم پاسخ ندهند.
- در صورت استفاده از نمونه بافت ، 1-2 قطره را به اسلاید شیشه ای اضافه کنید. به صورت یکنواخت روی اسلاید پخش کنید تا یک لایه نازک نمونه پاشیده شود ، آن را با استفاده از لبه اسلاید شیشه ای استریل دیگر بکشید. قبل از انجام مرحله بعد بگذارید خشک شود.
- اگر باکتری را از یک ظرف پتری می گیرید ، حلقه تلقیح را در مشعل Bunsen تا زمانی که درخشان شود استریل کنید ، سپس بگذارید سرد شود. از حلقه برای ریختن آب استریل روی لام استفاده کنید ، سپس قبل از استفاده از آن برای جمع آوری نمونه کوچکی از باکتری ، استریل کنید و دوباره سرد کنید. پس از آن به آرامی هم بزنید.
- باکتری های آماده شده در آبگوشت باید دوباره با استفاده از گرداب هم زده شوند ، سپس با حلقه تلقیح مانند بالا ، بدون افزودن آب ، گرفته شوند.
- اگر نمونه سواب دارید (معمولاً با یک دسته کوچک نوک پنبه انجام می شود) ، سواب را به آرامی لمس کرده و روی اسلاید بچرخانید.
مرحله 4. دمای کمی بالا می تواند یک اسمیر خوب ایجاد کند
گرما باکتری ها را در بالای لام نگه می دارد ، بنابراین در طول فرآیند رنگ آمیزی به راحتی حل نمی شوند. اسلاید را دو تا سه بار به سرعت روی مشعل Bunsen ضربه بزنید ، یا اسلاید را روی بخاری برقی برقی گرم کنید. بیش از حد گرم نکنید ، ممکن است نمونه آسیب ببیند. اگر از مشعل Bunsen استفاده می کنید ، باید به جای شعله نارنجی بزرگ ، شعله ای کوچک اما آبی باشد.
از طرف دیگر ، می توان یک اسمیر را با متانول تهیه کرد ، با افزودن 1-2 قطره متانول به یک اسمیر خشک ، و باقی ماندن متانول روی اسلاید با گذاشتن آن در هوای آزاد. این تکنیک آسیب سلول را به حداقل می رساند و یک پس زمینه تصویر اسلاید تمیز را فراهم می کند
مرحله 5. اسلاید را روی سینی رنگ آمیزی قرار دهید
سینی های رنگ آمیزی از صفحات فلزی ، شیشه ای یا پلاستیکی کم عمق با مش نرم در بالای آن ساخته شده اند. اسلایدها را روی این توری ها قرار دهید تا مایع مورد استفاده شما داخل سینی تخلیه شود.
اگر سینی رنگ آمیزی ندارید ، می توانید یک اسلاید روی سینی پلاستیکی قرار دهید تا تکه های یخ چاپ شود
روش 2 از 3: فرآیند رنگ آمیزی گرم
مرحله 1. مایع کریستال بنفش را روی اسمیر بریزید
از یک پیپت برای اسپری کردن نمونه ای از باکتری ها با چند قطره رنگ بنفش کریستالی ، که بنفش جنتیان نیز نامیده می شود ، استفاده کنید. بگذارید 30-60 ثانیه بماند. بنفش کریستالی (KV) در محلول آبی به یونهای KV+ و کلرید (Cl-) جدا می شود. این یونها به دیواره سلولی و غشای سلولی هر دو باکتری گرم مثبت و گرم منفی نفوذ می کنند. یون KV+ با اجزای دارای بار منفی سلولهای باکتری در تعامل است و به سلولها رنگ بنفش می دهد.
بسیاری از آزمایشگاهها از بنفش کریستالی "Hucker" استفاده می کنند که حاوی آمونیوم اگزالات برای جلوگیری از بارندگی است
مرحله 2. بنفش کریستال را به آرامی بشویید
اسلاید را کج کرده و از یک بطری واشر برای پاشیدن یک جریان کوچک آب مقطر یا شیر روی سرسره استفاده کنید. آب باید روی سطح اسمیر جاری شود و نباید مستقیماً روی لکه اسپری شود. بیش از حد آبکشی نکنید. می تواند رنگ آمیزی باکتری های گرم مثبت را از بین ببرد.
مرحله 3. لکه را با ید شستشو دهید ، سپس بشویید
با استفاده از قطره چکان لکه را با ید شستشو دهید. بگذارید حداقل 60 ثانیه روی پوست بماند ، سپس با روش مشابه بالا آبکشی کنید.) در لایه های داخلی و خارجی سلول. این مجموعه از ترکیبات رنگ بنفش بنفش کریستالی را در داخل سلول ، در نقاط رنگ آمیزی شده حفظ می کند.
ید یک ماده خورنده است. از استنشاق ، بلع یا تماس با پوست خودداری کنید
مرحله 4. سفید کننده رنگ را اضافه کنید ، سپس سریع بشویید
مخلوط استون و اتانول 1: 1 معمولاً برای این مرحله مهم استفاده می شود ، که باید به دقت زمان بندی شود. اسلاید را در زاویه خاصی قرار دهید ، سپس سفید کننده رنگ را اضافه کنید تا زمانی که دیگر بنفش در آبی که برای شستشو استفاده می شود دیده نشود. اگر سفیدکننده حاوی غلظت بالای استون باشد ، معمولاً کمتر از 10 ثانیه طول می کشد ، یا حتی کمتر. این مرحله را فوراً متوقف کنید ، در غیر این صورت رنگ بنفش کریستالی را از سلولهای گرم مثبت و منفی نیز شسته می شود و فرآیند رنگ آمیزی باید تکرار شود. هرگونه سفید کننده اضافی رنگ را فوراً با روش قبلی بشویید.
- استون خالص (95٪+) می تواند به عنوان جایگزین استفاده شود. هرچه استون بیشتری استفاده کنید ، سفید کننده سریعتر کار می کند ، بنابراین باید به زمان بندی توجه بیشتری داشته باشید.
- اگر در پیگیری زمان این مرحله با مشکل روبرو هستید ، سفیدکننده رنگ را قطره قطره اضافه کنید.
مرحله 5. ضد رنگ را روی اسمیر بپاشید ، سپس بشویید
برای افزایش کنتراست بین باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت ، از طریق رنگ آمیزی باکتریهای رنگ شده (رنگ زدایی) ، یعنی باکتریهای گرم منفی ، صورتی یا قرمز ، از یک لکه ضد رنگ ، معمولاً سافرانین یا فوکسین استفاده می شود. سپس آبکشی کنید
فوکسین به شدت بسیاری از باکتریهای گرم منفی مانند Haemophilus spp و Legionella spp را لکه دار می کند. این روش برای مبتدیان خوب است
مرحله 6. اسلاید را خشک کنید
می توانید آنها را در هوای آزاد خشک کنید تا خشک شوند ، یا آنها را با استفاده از کاغذ کتابخانه ای که برای این منظور فروخته شده است خشک کنید. فرایند رنگ آمیزی گرم کامل شده است.
روش 3 از 3: بررسی نتایج رنگ آمیزی
مرحله 1. میکروسکوپ نوری را آماده کنید
اسلاید را زیر میکروسکوپ قرار دهید. اندازه باکتری ها بسیار متفاوت است ، بنابراین کل بزرگنمایی مورد نیاز از 400x تا 1000x متفاوت خواهد بود. یک لنز عینی با روغن غوطه ور برای تصویر واضح تر توصیه می شود. روغن غوطه وری را روی اسلاید بریزید ، در حین چکیدن از حرکت جلوگیری کنید تا از ایجاد حباب جلوگیری شود. دسته لنز میکروسکوپ را طوری حرکت دهید که لنز شیئی در جای خود چسبیده و روغن را لمس کند.
غوطه ور کردن روغن را فقط می توان در لنزهای مخصوص طراحی کرد ، نه روی لنزهای "خشک"
مرحله 2. سعی کنید باکتری های گرم مثبت و گرم منفی را شناسایی کنید
لام را زیر میکروسکوپ نوری بررسی کنید. رنگ باکتریهای گرم مثبت بنفش به نظر می رسد ، زیرا بنفش کریستالی در دیواره سلولی ضخیم به دام افتاده است. رنگ باکتری های گرم منفی صورتی یا قرمز خواهد بود ، زیرا بنفش کریستالی از طریق دیواره های نازک سلول ، جایی که رنگ ضد رنگ صورتی وارد می شود ، شسته می شود.
- اگر نمونه خیلی ضخیم باشد ، نتیجه ممکن است مثبت کاذب باشد. اگر همه باکتریهای گرم مثبت را نشان می دهد ، یک نمونه جدید را رنگ آمیزی کنید تا از صحت نتیجه اطمینان حاصل کنید.
- اگر بیش از حد از سفید کننده رنگ استفاده می کنید ، نتیجه می تواند منفی کاذب باشد. اگر همه باکتریهای گرم منفی را نشان می دهد ، یک نمونه جدید را رنگ آمیزی کنید تا از صحت نتیجه اطمینان حاصل کنید.
مرحله 3. نتایجی را که مشاهده می کنید با تصویر مرجع مقایسه کنید
اگر نمی دانید باکتری ها چگونه به نظر می رسند ، مجموعه تصاویر مرجع را که معمولاً بر اساس شکل و رنگ آمیزی گرم مرتب شده اند ، مطالعه کنید. همچنین می توانید پایگاه های اطلاعاتی آنلاین را در [پایگاه ملی پاتوژن میکروبی ، باکتری ها در عکس ها و بسیاری از سایت های آنلاین دیگر مشاهده کنید. برای تسهیل شناسایی ، در زیر نمونه هایی از باکتری هایی که معمولاً با آن ها روبرو می شوید یا برای تشخیص مهم هستند ، بر اساس وضعیت و شکل گرم آنها طبقه بندی شده است.
مرحله 4. باکتریهای گرم مثبت را بر اساس شکل آنها شناسایی کنید
باکتریها با توجه به شکل آنها در زیر میکروسکوپ طبقه بندی می شوند که بیشتر به صورت کوکی (کروی) یا میله ای (استوانه ای) طبقه بندی می شوند. در اینجا چند نمونه از باکتریهای گرم مثبت (رنگ بنفش) با توجه به شکل آنها آورده شده است:
- کوکوهای گرم مثبت معمولاً استافیلوکوک (به معنی کوک گروه) یا استرپتوکوک (به معنی کوک زنجیره ای) است.
- میله های گرم مثبت مانند باسیلوس ، کلستریدیوم ، کورینباکتریوم و لیستریا. باکتری میله ای Actinomyces spp. معمولاً شاخه یا رشته دارند.
مرحله 5. باکتری های گرم منفی را شناسایی کنید
باکتریهای گرم منفی (رنگ صورتی) اغلب به سه گروه طبقه بندی می شوند. کوکوها شکل کروی دارند ، میله ها بلند و نازک هستند ، در حالی که میله های کوکوئید در بین آنها قرار دارد.
- کوکوهای گرم منفی رایج ترین آنها Neisseria spp است.
- میله های گرم منفی به عنوان مثال E. coli ، Enterobacter ، Klebsiella ، Citrobacter ، Serratia ، Proteus ، Salmonella ، Shigella ، Pseudomonas و بسیاری دیگر. ویبریو کلرا را می توان به عنوان یک ساقه معمولی یا یک ساقه خمیده مشاهده کرد.
- باکتری های میله ای "coccoid" (یا "coccobacilli") گرم منفی به عنوان مثال بوردتلا ، بروسلا ، هموفیلوس و پاستورلا
مرحله 6. اگر نتایج مخلوط شده اند ، به دقت بررسی کنید
رنگ آمیزی برخی از باکتری ها به دلیل شکنندگی یا مومی بودن دیواره های سلولی آنها دشوار است. این باکتری ها ممکن است مخلوطی از رنگ بنفش یا صورتی را در یک سلول یا بین سلول های مختلف در یک اسمیر نشان دهند. نمونه های باکتریایی قدیمی تر از 24 ساعت می توانند این مشکل را نشان دهند ، اما برخی گونه های باکتریایی نیز وجود دارند که رنگ آمیزی آنها در هر سنی از نمونه گیری مشکل است. این باکتری ها برای شناسایی نیاز به آزمایشات تخصصی تری مانند رنگ آمیزی سریع اسیدی ، مشاهده در کشت باکتریایی ، محیط کشت TSI یا آزمایش ژنتیک دارند.
- Actinomyces ، Arthobacter ، Corynebacterium ، Mycobacterium و Propionibacterium spp. همه باکتری های گرم مثبت هستند ، اما اغلب به طور واضح رنگ آمیزی نشده اند.
- باکتری های کوچک و باریک مانند Treponema ، Chlamydia و Rickettsia spp. مشکل است که با روش گرم رنگ آمیزی شود.
مرحله 7. وسایل مصرفی و تجهیزات باقی مانده را دور بریزید
این روش دفع زباله بین آزمایشگاه ها متفاوت است و به مواد مورد استفاده بستگی دارد. به طور معمول ، مایع موجود در سینی رنگ آمیزی در بطری هایی که به عنوان زباله های خطرناک برچسب گذاری شده اند ، دور ریخته می شود. اسلاید را در محلول سفید کننده 10 ak خیس کنید ، سپس در یک ظرف تیز بریزید.
نکات
- به یاد داشته باشید که نتایج رنگ آمیزی گرم تنها در صورتی خوب خواهد بود که نمونه خوب باشد. اطلاع رسانی به بیماران بسیار مهم است تا بتوانند نمونه خوبی را ارائه دهند (مثلاً تفاوت بین تف کردن در مقابل سرفه عمیق برای بدست آوردن نمونه خلط).
- به عنوان سفید کننده رنگ ، اتانول کندتر از استون واکنش نشان می دهد.
- برای اطمینان از ایمنی ، از مقررات استاندارد آزمایشگاهی پیروی کنید.
- برای تمرین از سواب گونه استفاده کنید ، زیرا حاوی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی است. اگر فقط یک نوع باکتری مشاهده می کنید ، ممکن است از سفید کننده بسیار کم یا زیاد استفاده کنید.
- برای محکم نگه داشتن سرسره می توانید از بست های چوبی استفاده کنید.
هشدار
- استون و اتانول مواد قابل اشتعال هستند. استون چربی را از دست شما خارج می کند و جذب مواد شیمیایی دیگر را برای پوست شما آسان می کند. دستکش بپوشید و با احتیاط از آنها استفاده کنید.
- اجازه ندهید لکه قبل از شستن لکه گرم یا ضد لکه خشک شود.
آنچه شما نیاز دارید
- نمونه شبکه
- سرسره شیشه ای
- پیپت
- منبع آتش کوچک یا بخاری سرسره یا متانول
- اب
- بنفش کریستالی
- ید
- سفید کننده های رنگی ، مانند الکل یا استون
- سافرانین
